Комплекс по определению азота и белка «кельтран»

Содержание

1 Область применения…………………………………………………………1

2 Нормативные ссылки…………………………………………………………1

3 Термины и определения………………………………………………………2

4 Сущность метода……………………………………………………………2

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы………………….3

6 Отбор проб………………………………………………………………..4

7 Подготовка к проведению измерений…………………………………………….4

8 Условия проведения измерений…………………………………………………5

У Проведение измерений……………………………………………………….&

10 Обработка результатов измерений……………………………………………..6

11 Проверка приемлемости результатов измерений……………………………………б

12 Оформление результатов измерения……………………………………………9

13 Требования, обеспечивающие безопасность………………………………………9

14 Требования к оператору……………………………………………………..9

Приложение А (обязательное) Схема прибора для отгонки аммиака методом Кьельдаля……….10

Библиография………………………………………………………………11

\AV

Установки для титрования

Последняя стадия — определение аммонийного азота с помощью титрования: ручного или автоматического, на выбор.

В комплект входит:

• лабораторная магнитная мешалка ПЭ-6100 или аналогичная
• бюретка 1-3-2-25-0,1 без крана с зажимом
• штатив лабораторный ШЛ-02.

Вместо ручной титровальной установки может быть поставлен полуавтоматический или автоматический титратор.

Автоматическое титрование — Комплект «Титрион-рН»

Автоматическое потенциометрическое кислотно-основное титрование водных и некоторых неводных растворов.

«Титрион-рН» позволяет полностью автоматизировать процесс титрования до заданной точки. Значение объема титранта, пошедшего на титрование, определяется прибором автоматически. Кроме того, «Титрион-рН» имеет режим регистрации кривой титрования. Построение кривой и определение точки эквивалентности (значения эквивалентного объема) производится прибором также автоматически.

Оборудование сертифицировано и позволяет определить азот белка по методу Кьельдаля в пищевых продуктах, молочных продуктов, кормах, воде, напитках, медикаментах, химических веществах, почве.

Метод 6 (Флуорометрический метод с о-фталальдегидом)

Метод основан на дериватизации белка о-фталальдегидом, который реагирует с первичными аминогруппами белка (N-концевая аминокислота и
ε-аминогруппа остатков лизина) с последующим измерением флуоресценции полученного комплекса. Чувствительность количественного определения может быть увеличена гидролизом белка перед добавлением о-фталальдегида. Гидролиз делает α-аминогруппу, входящую в структуру аминокислот, доступной для взаимодействия с фталальдегидным реактивом. Метод является высокочувствительным и требует небольшого количества белка.

Определению мешают  буферные растворы, содержащие первичные амины, такие как трис(гидроксиметил)аминометан, и аминокислоты, которые взаимодействуют с о-фталальдегидом. Аммиак в больших концентрациях также взаимодействует с о-фталальдегидом. Флуоресценция, полученная при взаимодействии аминов с о-фталальдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных методик для стандартизации данного метода позволяет повысить точность и воспроизводимость определения.

Стандартные растворы. Растворяют соответствующий стандартный образец белка в 0,9 % растворе натрия хлорида. Части полученного раствора разводят 0,9 % раствором натрия хлорида для получения не менее пяти стандартных растворов с концентрациями в интервале от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл. Доводят значение рН раствора до 8,0 — 10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в 0,9 % растворе натрия хлорида с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций стандартных растворов. Доводят значение рН раствора до 8,0-10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Контрольный раствор. Используют 0,9 % раствор натрия хлорида.

Методика. Смешивают 10 мкл испытуемого раствора, каждого из стандартных растворов и контрольного раствора с 0,1 мл фталальдегидного реактива и выдерживают при комнатной температуре в течении 15 мин. Прибавляют 3 мл 0,5 М раствора натрия гидроксида и перемешивают. Определяют интенсивность флуоресценции испытуемого раствора и каждого из стандартных растворов при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания между 440 нм и 455 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Измеряют интенсивность флуоресценции указанных растворов только один раз, поскольку излучение снижает интенсивность флуоресценции.

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка носит линейный характер. Строят график зависимости интенсивностей флуоресценции стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и интенсивности флуоресценции испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофлуориметра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечания:

Приготовление боратного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 61,83 г борной кислоты и растворяют в воде и доводят рН до значения 10,4 при помощи раствора калия гидроксида. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Приготовление исходного раствора фталальдегида. 1,20 г фталальдегида растворяют в 1,5 мл метанола, прибавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Прибавляют 0,6 мл 30 % раствора макрогол 23 лаурилового эфира (300 г/л) и перемешивают.

Хранят при комнатной температуре и используют в течение 3 недель.

Приготовление фталальдегидного реактива. К 5 мл исходного раствора фталальдегида прибавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола. Раствор следует готовить не менее чем за 30 мин перед использованием.

Используют в течение 24 часов.

Дигестор «КЕЛЬТРАН» УК-4005

Самым трудоемким и продолжительным этапом является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное «сжигание» образца в серной кислоте.

Скорость озоления и разрушения образца во многом зависит от температуры обработки, чем она выше — тем меньше времени уходит на разложение. Также увеличить скорость озоления позволяет добавление катализатора.

Печь для мокрого озоления — полуавтоматическая установка для проведения разложения по методу Кьельдаля, проводит подготовку проб (сжигание пробы в кислоте в присутствии катализатора при высокой температуре).

В комплекте:

• дигестор (нагревательный блок)
• комплект термостойких пробирок Ø45 мм (рекомендуется заказать дополнительный комплект пробирок)
• скруббер
• водоструйный насос
• документация «Методика работы».

Преимущества:

• Высокая рабочая температура (до 450 °С) и низкая инерционность нагрева позволяют существенно сократить время сжигания
• Возможность установки до 10 этапов нагрева (температура и продолжительность) позволяет подобрать оптимальный вариант сжигания для разных типов продуктов
• 10 программ позволяют настроить и сохранить в памяти температурные режимы для различных продуктов
• Печь снабжена микропроцессорным управлением и ЖКИ экраном для предварительной установки программ и отслеживания хода каждого этапа в процессе работы
• Пробирки из высококачественного термостойкого стекла обеспечивают высокий уровень безопасности
• Опция: автоматический подъемник для подъема и опускания штатива с колбами, позволит минимизировать время занятости персонала (по спецзаказу)

7 Подготовка к проведению измерений

7.1 Приготовление реактивов

7.1.1 Приготовление смешанного катализатора

В фарфоровой ступке смешивают одну весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают пестиком и перемешивают до получения мелкозернистого порошка.

Срок хранения смешанного катализатора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI)а 0,1 моль/дм3

Используют стандарт-титр соляной кислоты. Раствор готовят в соответствии с прилагаемой к набору инструкцией. Срок хранения раствора в плотно укупоренной посуде из темного стекла — не более 1 мес.

Примечание — При отсутствии сгандарт-гитра приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм3 и установку его точной концентрации (поправочного коэффициента) допускается проводить по ГОСТ 25794.1.

7.1.3 Приготовление раствора борной кислоты массовой концентрации 40 г/дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают (40.000 ± 0.005) г борной кислоты и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды температурой (45 1 5) ЭС. После охлаждения раствора до температуры (20 ± 5) *С объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора — не более 14 сут.

7.1.4 Приготовление смешанного индикатора

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,200 1 0.001) г метилового красного и (0,100 ± 0,001) г метиленового голубого (или (0.100 ±0.001) г бромкреэолового зеленого], растворяют в небольшом количестве этилового спирта. Объем раствора доводят этиловым спиртом до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора а плотно укупоренной посуде из темного стекла — не более 10 сут.

7.1.5 Приготовление раствора гидроокиси натрия массовой концентрации 400 г/дм3

В фарфоровый стакан вместимостью 1000 см3 помещают (400.000 ± 0.005) г гидроокиси натрия, растворяют в 700 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения гидроокиси натрия. охлаждают до комнатной температуры и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора — не более 14 сут.

7.2 Подготовка прибора для отгонки аммиака

Прибор для отгонки аммиака собирают в соответствии с рисунком, приведенным в приложении А. или в соответствии с инструкцией к прибору.

В колбу 1 через воронку 2 наливают дистиллированную воду (примерно на 2/3 объема) и открывают зажимы 13. Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке. Присоединяют пустую колбу Кьельдаля 7 к каплеуловителю 6 и воронке для гидроокиси натрия 4 и после того, как вода закипит, закрывают крайний левый зажим. Включают холодильник 8. подставляют под него пустую коническую колбу 1 вместимостью 250 см3 и прибор «пропаривают» в течение 5—10 мин.

7.3 Подготовка пробы исследуемого продукта

7.3.1 Продукты без пищевкусовых компонентов или содержащие пищевкусовые компоненты, образующие с продуктом однородную структуру (кофе, какао, фруктово-ягодные добавки и т. п.), или не-отделяемые пищевкусовые компоненты (кокосовую стружку, дробленые орехи и т. п.), максимально освобождают от упаковки, помещают в стакан вместимостью 600 см3 и нагревают на водяной бане до температуры (32 ± 2) *С. тщательно перемешивая шпателем до получения однородной массы, не допуская разжижения продукта и освобождая его от воздушных пузырьков. После чего продукт помещают в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 3—5 мин при частоте вращения ножей от 2000 до 5000 мин 1 до получения однородной массы. Подготовленный образец переносят в колбу вместимостью 500 см3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (2012) °C.

во избежание расслоения пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации.

Творог, творожные и сухие продукты помещают в фарфоровую ступку, тщательно перемешивают и растирают, добиваясь однородности.

7.3.2 Продукты с отделяемыми пищевкусовыми компонентами и декорированные (орехи, печенье, вафли в виде декора, глазурь, начинки в виде стержня и другие отделяемые компоненты) максимально освобождают от наполнителей, глазури и декора и далее проводят процедуры по 7.3.1.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Весы лабораторные с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0001 г и ±0,01 г.Термометр лабораторный жидкостный диапазоном измерения от 0 °C до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752.Плитка электрическая мощностью 1000 Вт по ГОСТ 14919; электронагреватели или газовые горелки, позволяющие поддерживать температуру от 450 °C до 500 °C с допустимой погрешностью ±25 °C.Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, угловой скоростью вращения ножей 1000-10000 мин, включающий емкость вместимостью 1,0 дм.Баня водяная термостатируемая, позволяющая поддерживать температуру от 0 °C до 100 °C с допустимой погрешностью ±2 °C.Шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий поддержание температуры от 50 °C до 150 °C с допустимой погрешностью ±2 °C.Колбы мерные 1-100-2, 1-500-2, 1-1000-2 или 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.Цилиндры мерные 1-25-1, 1-50-1, 1-100-1, 1-1000-1, или 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2, или 3-25-1, 3-50-1, 3-100-1, 3-1000-1, или 3-25-2, 3-50-2, 3-100-2, 3-1000-2 по ГОСТ 1770.Бюретки 1-1-2-25-0,1 или 1-2-2-25-0,1 по ГОСТ 29251.Холодильник по ГОСТ 25336 шариковый или с прямой трубкой исполнений 1, 2, 3, длиной кожуха 400 мм.Бачок-парообразователь или колба из термостойкого стекла вместимостью 2000 см по ГОСТ 25336.Колбы Кьельдаля 2-250-ТС по ГОСТ 25336.Пробирки из кварцевого стекла.Каплеуловитель исполнения КО-60 по ГОСТ 25336.Стаканчики для взвешивания типа СВ (бюксы) диаметром 20 или 25 мм по ГОСТ 25336.Колбы конические исполнения 2, вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.Колбы плоскодонные с притертыми пробками вместимостью 250 и 500 см ТС по ГОСТ 25336.Стакан вместимостью 500 см по ГОСТ 25336.Воронки В-25-38 ХС, В-36-50 ХС, В-36-80 ХС по ГОСТ 25336.Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.Стакан фарфоровый вместимостью 1000 см по ГОСТ 9147.Капельница стеклянная лабораторная по ГОСТ 25336.Палочки стеклянные оплавленные.Шпатель металлический (фарфоровый) или ложка.Кислота серная концентрированная по ГОСТ 4204 плотностью 1830-1840 кг/м, х.ч.Кислота соляная, стандарт-титр по , водный раствор молярной концентрации (НС1)=0,1 моль/дм.Кислота борная по ГОСТ 9656, ч.д.а.Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а.Медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.д.а.Калий сернокислый по ГОСТ 4145, ч.д.а.Водорода перекись 30%-ная.Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769.Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.Метиловый красный, ч.д.а.Метиленовый голубой, ч.д.а.Бромкрезоловый зеленый, ч.д.а.Сахароза по ГОСТ 5833, содержащая не более 0,002% азота.Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.L-триптофан по или лизин моногидрохлорид по .Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

13 Требования, обеспечивающие безопасность

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007;- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с требованиями ГОСТ Р 12.1.019.Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.009.

Метод 7 (Определение белка по содержанию азота)

Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16 %. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25.

На результаты определения будут оказывать влияние другие азотсодержащие вещества, присутствующие в испытуемом образце.

Методика определение белка по содержанию азота основана на разложении испытуемого образца в ходе проведения анализа, но не лимитирована содержанием белка в водной среде. При нагревании азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной, азот превращается в аммония сульфат, который можно определить количественно.

Метод А (Метод Къельдаля)

Определение проводят в соответствии с требованиями, указанными  в ОФС «Определение азота в органических соединениях» (метод 2 – микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10 – 20 мг белка. После минерализации азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной азот превращается в аммония сульфат, который можно определить количественно.

Метод Б

Большинство приборов для определения азота используют пиролиз, то есть сжигание  образца в кислороде при температуре приблизительно 1000 °С, в ходе которого выделяется азота монооксид (NO) и другие оксиды азота (NO_x), из азота присутствующего в испытуемом веществе. Некоторые приборы преобразуют оксиды азота в азот, который количественно определяется с помощью детектора по теплопроводности. В других приборах азота монооксид (NO) смешивается с озоном (О₃)  для получения азота диоксида (NO₂ *) в возбужденном состоянии, испускающего свет при распаде, который может быть количественно определен с помощью хемилюминесцентного детектора. Для оптимизации навески и параметров пиролиза и обеспечения стабильности показателей при проведении анализа используется стандартный образец соответствующей чистоты и подходящий по составу с исследуемому белку.

Расчеты. Концентрацию белка рассчитывают путем деления содержания азота в испытуемом образце на известное содержание азота в исследуемом белке. Известное содержание азота в белке можно определить исходя из химического состава белка или путем сравнения с подходящим стандартным образцом.

Скачать в PDF ОФС.1.2.3.0012.15 Определение белка

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие тре*

бования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ ISO 707—2013 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб**

ГОСТ ИСО 5725-1—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов из

мерений. Часть 1. Основные положения и определения***

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707—2010 о Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

*“ В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».

Издание официальное

ГОСТ ИСО 5725-6—2003 Точность (правильность и прецизионность} методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике2

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3769—78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4145—74 Реактивы. Калий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4165—78 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5833—75 Реактивы. Сахароза. Технические условия

ГОСТ 5962—2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656—75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 14919—83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1—83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 27752—88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29251—91 (ИСО 385-1—84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национагъные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.